viia7荧光定量pcr仪_viia7荧光定量pcr仪软件

viia7荧光定量pcr仪_viia7荧光定量pcr仪软件

       大家好，很高兴能够为大家解答这个viia7荧光定量pcr仪问题集合。我将根据我的知识和经验，为每个问题提供清晰和详细的回答，并分享一些相关的案例和研究成果，以促进大家的学习和思考。

1.bio-radCFX连接不上设备

2.PCR仪的PCR仪的分类

3.实时荧光定量 PCR

4.PCR仪的介绍

5.请学生物的同学帮忙介绍一下“PCR”

6.PCR实验室主要仪器设备和耗材清单

bio-radCFX连接不上设备

关机重连。

       bioradCFX是一款荧光定量PCR仪，连接不上设备一般都是接触不良或者没有反应过来，不管哪种情况，只要关机重启一下就可以了。

       bioradCFX由荧光定量系统和计算机组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。

PCR仪的PCR仪的分类

       实时就是指每个阶段的荧光都有收集，其实现在所有的荧光定量PCR仪器都是实时的。荧光定量PCR的英文简写是：FQ-PCR，F是荧光的缩写，Q是定量的缩写。（或者写成是RT-PCR。RT就是realtime的缩写）。

       做定量PCR的目的是为了了解起始模板数的量，这个一下写不清楚，你看一个说明书绝对看得懂。

       而反转录PCR就是把mRNA反转录成cDNA，简写也是RT-PCR。不过和上面的不同！这个RT是reverse transcript的缩写！

       其实啊，对于做表达量的实验而言，反转录PCR是荧光定量PCR的第一步，很多人是这么来描述的：RT-qPCR。这个RT就是反转录，这个q是指定量。

       总之，自己好好看说明书！

实时荧光定量 PCR

        在普通PCR仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，就成了荧光定量PCR仪。其PCR扩增原理和普通PCR仪扩增原理相同，只是PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出。把这PCR仪叫做实时荧光定量PCR仪(qPCR仪)。荧光定量PCR仪有单通道，双通道，和多通道。当只用一种荧光探针标记的时候，选用单通道，有多荧光标记的时候用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记的目的基因表达产物，因为一次只能检测一种目的基因的扩增量，需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。该仪器主要用于医学临床检测，生物医药研发，食品行业，科研院校等机构。

PCR仪的介绍

        实时荧光定量 PCR ，简称 RT-QPCR, 属于 Q-PCR 的一种，目前该技术已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、 SNP 分析等。荧光定量 PCR 常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR GreenⅠ的非特异性方法。

        SYBR Green I 是一种结合于所有 dsDNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的荧光染料， 可与所有的各种序列的双链 DNA 分子结合。 在 游离状态 下，SYBR Green I 发出 微弱的荧光 ，但 一旦与双链 DNA 结合 ， 嵌入至 dsDNA， 荧光大大增强 。

        因此， SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关， PCR 扩增不同时期中， dsDNA 含量不同， SYBR Green I 荧光信号强度不同。 可以根据荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量， 并可根据对照进行相关的计算和分析。

        实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材。

        试剂包括：特异性 PCR 引物，新鲜提取备用的总 RNA。

        使用的试剂盒有：用于合成 cDNA 第一链的罗氏试剂盒 Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis Kit，包含了 cDNA 反应所需要的所有实验组分以及相关的正对照反应组分。

        配套 LightCycler? 480 使用的试剂盒 LightCycler? 480 SYBR Green I Master，包含了 PCR 所需的各种实验组分，如 1 号管中包含热启动 Taq DNA Polymerase及反应缓冲液， dNTP mix， SYBR Green I 染料和 MgCl2正式试验开始前，冰上解冻各个试剂及试剂盒组分，置于冰上待用。 注意：SYBR Green I Master 需避光放置。

        所需仪器与耗材有：罗氏 LightCycler? 480 全自动实时定量 PCR 仪以及配套使用的 96 或 384 多孔板，透明封板膜等一次性耗材。赛默飞公司提供的 Thermo Scientific Arktik PCR 仪、单道移液器、 Nunc 冰盒及 QSP 盒装吸头等。

        接下来进入实验部分，本实验操作流程是：首先用新鲜提取的 RNA 反转录合成 cDNA 第一链，然后进行实时荧光定量 PCR，其中包括： SYBR Green 反应体系的配置； PCR 程序设置； 运行 PCR 实验，样品编辑和结果分析。

        首先是反转录合成 cDNA 第一链：

        实验操作时注意：所有 RNA 相关的操作均要佩戴手套，防止 RNase 污染。相关操作严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。

        按照体系配方在冰上的 Rnase free 的灭菌 PCR 管中配置 Template primer mix，总体系 13μl，本实验是联合使用 anchored oligo dT 引物和随机六聚体引物进行的反转录。 先配置 NTC 对照，加入 9 号管水 10μl、 6 号管的 50mM oligo dT 引物 1μl、 5 号管的 0.6mM 随机六聚体引物 2μl，混匀。 然后进行样品一号管的体系配置， 依次加入 1μl 已调整浓度的总 RNA、 1μl oligo dT 引物、 2μl 随机六聚体引物、最后加 9μl 水补充至总体积 13μl，混匀。其他样品管，参照 1 号管的配置方法，依次加好反应体系。注意：可将总 RNA的模板量适当调整至 10ng-5μg，mRNA调整至 1-100ng。

        若 RNA 样品浓度较低，则可加入 10μg/ml 的 MS2 RNA 来稳定模板 RNA。

        将配好的反应 mix 在 PCR 仪中 65℃变性 10min，可有效减少 RNA 的二级结构。加热后迅速置于冰上骤冷，放置 5min。在反应 Template primer mix 中按体系配方顺序，依次加入以下试剂： 2 号管的 5×反转录酶 buffer， 4 号管 dNTP mix， 3 号管 40 U/μl 的 RNase 抑制剂， 1 号管 20 U/μl 的反转录酶，最终体积为 20μl。

        若样品数较多，先配置反应 mix 再分装，小心吸打混合，切勿涡旋振荡。 混匀后于瞬时离心机上短暂离心，使样品和反应液落至离心管底部。将离心管放置 PCR 中，根据使用的引物以及目标 mRNA 的片段长度进行程序设置。本实验反应温度和时间设置为： 25℃， 10min， 55℃反应 30min。反应完毕后，于 85℃下加热 5min 灭活反转录酶， 再置于冰上停止反应。此反应产物可于 2-8℃存放 1-2h，或在-15 至-25℃下存放更长时间。

        cDNA 产物无需进行纯化即可用于后续的 PCR 反应。 20μl 的 PCR 反应体系可取 2-5μl cDNA 反应产物进行扩增。此试剂盒中的反转录酶具有 RNase H 活性，可以在 cDNA 合成之后去除 RNA 模版，减少其对后续 PCR 的影响。

        本部分实验，我们选用罗氏的 SYBR Green I Master 试剂盒进行基础的绝对定量分析。

        本实验共设置 5 个标准样品，包含 1 个标记为 0 的空白对照， 5 个反转录样品，包含 NTC 对照，由于样品数较多，先配制不含模版的总体系，再分装为10管，加入各个样品的模板后，再将每个样品分装为 3 个复孔。

        按照体系配方分别加入绿色盖子的 2×Master Mix， 10x Primer 上下游引物，PCR 级别水。 总体系配好后，在用移液枪轻柔吸打均匀，然后分装为 10 管，每管 55μl。往 10 管中分别加入各个样品对应的调整好浓度的 cDNA。STD 零加入 6μl 水代替模板，其余 STD 分别加入 6μl 已经逐级稀释好的标样模板。 反转录样品分别加入 6μl 浓度调整好的模板 DNA， 包含 NTC。混匀，然后将每个样按 20μl 每孔分装至 96 孔板中。用封孔膜盖好 96 孔板，将多孔板置于合适的离心机中 1500×g 配平离心 2min 将准备好的 96 孔板放置在LightCycler? 480 设备中。

        双击打开 LightCycler? 480 的 1.5 软件并登陆，自动进入软件界面，点击 new experiment,在 Detection Format 选项中选择 SYBR Green I 模式, 点击 OK 完成检测通道的设定,接下来设置反应体积，对于 96 模块，反应体系为 10μl-100μl 之间，本实验是设定 20μl 的反应体系。

        在 Program Name 中输入反应名称 pre incubation，预变性设定 1 个循环，无需进行荧光的收集，执行的温度和时间设定为 95℃ 10min，视图会根据设定进行实时的调整。

        点击增加按钮，输入 Amplification，定义扩增循环的次数为 45 次，并选择荧光的收集功能 Quantification，然后设定 PCR 扩增循环的温度与时间为 95℃ 10s，点击增加按钮，设定退火温度和时间为 60℃ 10s，以上两步 Acquisition Mode 都默认选择 None，继续点击增加按钮，设置延伸温度和时间为 72℃ 20s，Acquisition Mode 选择 Single， Ramp Rate 均按自动调整值，无需再设置。

        设置溶解曲线，在 Program 中的新的一行中输入 Melting Curves， 1 个循环数， Analysis Mode 选择 Melting Curves，时间和温度设置为 95℃ 5s， 点击增加按钮，新增设置温度和时间为 65℃ 1min，以上两步 Acquisition Mode 都默认选择 None。点击增加按钮，新增设置温度为 95℃，Acquisition Mode 选择 Continuous,其他设置无需改动。

        设置保温的过程 Cooling，只需 1 个循环，无需收集荧光，设定温度和时间为 40℃、 1min。设置完成后点击右边的保存按钮保存设置的程序。此时整个 PCR的循环体系、温度的设置已经设定完毕。

        点击 Start run 开始运行 PCR 反应，此时可在软件上实时监测样品扩增情况。

        实验结束，点击 Sample Editor，进入样本编辑区。

        Select Workflow 中选择 Abs Quant。根据样本在板中排布的方式进行样本编辑。设置阴性对照、空白对照、标准品以及未知样品等。

        在 Select Sample 中，选中需要设置的样品孔。在下一栏中的 Sample Name 输入被选择样品组的名称，并在 Sample Type 中选择样品组的类型，最后点击 Make Replicates 设置复孔。标准品设置时，需填写拷贝数，只需填写好稀释倍数，初始浓度即可。 编辑好样品后，即可进行数据分析。如有需要，也可进行子集编辑。

        样品编辑好后，可进行实验结果分析。

        点击左边栏下方的 sum 按钮，相应出现实验的所有信息，包括：设计的反应程序，实验结果分析等。

        点击 analysis，可以根据样品已有的数据进行细致准确地分析。

        点击 Abs Quant second derivative max，弹出 create new analysis 窗口，在 Subset 选项中选择分析样品的分布区域，点击确定，即可出现分析图：相应样品的扩增曲线。

        Standard Curve 是根据标准品得出的标准曲线，曲线左侧标有扩增效率、斜率、截距、线性关系、以及错误率。一般“Error”值越小，说明实验的准确率越高。

        扩增效率如果越接近“2”，说明这次的扩增反应越好。

        在数据表格，可显示单个样本的 Cp 值，以及相应的样本浓度值。

        按复孔进行数据统计，显示 Cp 平均值，方差，浓度的平均值以及方差。

请学生物的同学帮忙介绍一下“PCR”

       简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内In Vitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。目前常用的技术，可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。根据DNA扩增的目的和检测的标准，可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR仪，原位PCR仪，实时荧光定量PCR仪四类。

PCR实验室主要仪器设备和耗材清单

       PCR

        一、PCR概述

       1、什么是PCR

        聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。 由美国科学家PE（Perkin Elmer珀金-埃尔默）公司遗传部的Dr. Mullis发明，由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了1993年化学诺贝尔奖。

       2、PCR技术发展史

        PCR原理是由一对引物介导，能在动植物体外对特定基因(DNA)片断进行快速酶促扩增，经过n个热循环扩增，扩增产物中所含特定基因数是原始模板数的(1+E)n(0＜E＜1,扩增效率＝倍，使得检测扩增产物中的特定基因成为可能。

       聚合酶链式反应自从1993年到现在很快经历了四代产品：

第一代：手动/机械手式水浴基因扩增

       如上图所示，用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定在三个温度：PCR的高温变性温度（如94℃）低温复性温度（如58℃），适温延伸温度（如72℃）。再用一个装有PCR标本试管的提篮，用手工在不同温度的水浴箱中依次水浴，标本在每个水浴箱中恒温的时间用秒表计时。这样PCR标本就能完成下述形式的热循环：

       94℃ 30S 58℃ 45S 72℃ 60S

        40次循环

        这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容易因疲劳引起差错；而优点是:设备简单，投资少，与自动化基因扩增仪相比，它无须升降温过程，实验时间短，试验更接近理想PCR反应条件，事实表明实验效果还是不错的，但由于标本试管从一个水浴箱往另一个水浴箱移动中要较短暂暴露于空气中，因此如移动速度不够快时也会对标本形成温度干扰，影响结果。本方法的另外一些缺点包括只能局限三个温阶（某些PCR反应需要多于三个温阶）、液体污染以及在低气压地区水温难以烧到94℃变性温度等。

        为改进提高本方法的自动化水平，有人设计了机械手装置，替代上述手工移动标本过程，形成了机械手水浴式基因扩增仪，该改进解决了实验人员的高强度劳动问题，但又带来了一个机械手部件大行程频繁相对运动而引起的高故障。这种类型的基因扩增仪在九十年代中期我国北京、上海有定型的产品销售，应用也较广，曾为我国的分子生物学的发展做出过积极贡献，而后便逐步被自动化程度更高的扩增仪替代，现在很少有单位使用。

第二代：自动化控制型定性基因扩增仪

        与上述水浴式扩增仪相比，也有人称该种扩增仪为干式基因扩增仪，它是最具代表性的扩增仪，包括后续介绍的第三代、第四代都是以第二代为基础集成了定量检测部分。

第三代：终点定量/半定量

        第二代的定性PCR只能判断阴性阳性，而无法评价特定核酸的浓度及定量分析，定量PCR至少能达到定性PCR无法实现的下列功能：

        ?潜伏期病毒浓度探测

        ?感染程度

        ?致病病原体数量变化测定

        ?抗病毒药物疗效评估

        ?恢复期病毒载量检测

        自从1996年美国ABI公司发明第一台荧光定量PCR仪以来，PCR技术和应用从定性向定量快速发展.终点定量PCR的优点是设备投资少，对于国内经济条件还不能购买昂贵实时荧光定量PCR仪的科研单位和医疗机构，利用现有的第二代常规定性PCR仪，在添加一台专用的单孔PCR终点产物荧光定量检测仪便可开始工作，起到定量的作用。终点定量PCR技术是从定性向实时定量过渡的一个中间产品，而PCR终点产物荧光定量仪进口产品较少，国产仪器较多，如西安天隆的TL988，上海棱光的DA620型等

        第四代：实时定量PCR

        实时定量QPCR仪＋实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。

       见下图：(略)

       2、实时荧光定量PCR的优势：

        设备由荧光定量系统和计算机组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平，这就是分析荧光数据的水平。样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值（限制点的循环数）。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大，这样可以获得最准确，可重复性的数据。如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。

       3、实时荧光定量PCR技术原理

        所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在 real-time 技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：（1）在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能。（2）此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-time Q-PCR方法在研究工作中的运用。

        PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR 中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。在real-time Q-PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲 线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点 上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在real-time Q-PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个域值（threshold）是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 （baseline），荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义 样本的域值循环数（Ct）。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的 对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样 品的起始拷贝数。

       4、实时荧光定量PCR技术在医疗方面的应用

       ⑴ 病原体检测：目前，采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。

       如：结核菌基因诊断的意义主要表现在：

       a.区分TB与其它分枝杆菌；

       b.检测TB耐药基因；

       c.提高TB的阳性检出率。

       ⑵ 产前诊断：到目前为止，人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。

       ⑶ 药物疗效考核：对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析显示：病毒量与某些药物的疗效关系。HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，而HCV低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异。如PCR技术在HBV检测中的应用及意义：

       a.了解乙肝病毒在体内存在的数量。

       b.是否复制。

       c.是否传染，传染性有多强。

       d.是否有必要服药。

       e.肝功能异常改变是否由病毒引起。

       f.判断病人是适合用哪类抗病毒药物。

       g.判断药物治疗的疗效。

       ⑷ 肿瘤基因检测：尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。随着与肿瘤相关的新基因的不断发现，荧光定量PCR技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。

       (5)在优生优育中的应用:

       近年来经济发展迅猛，人民生活水平逐年提高，对自身及家人特别是下一代的身体健康愈来愈重视。另外，由于国内计划生育工作逐步走向深化，独生子女比较多，孩子的身体素质更成为长辈们关注的焦点。因此，怎样提高新生儿质量改善人类遗传素质，即优生优育已显得非常重要。①避免有严重遗传性疾病和先天性疾病的个体出生。②增进体力、智力优秀个体的繁衍。其中避免有严重遗传性疾病及先天性疾病个体出生是优生优育最基本的内容。从临床优生学角度分析具体工作包括在母亲妊娠期间对母亲及胎儿进行遗传学检查尽量排除常见的遗传性疾病个体的出生，另外在妊娠期检查母亲是否患有某些易引起胎儿畸形的传染性疾病如弓型虫、风疹病毒、衣原体等感染。以往对遗传性疾病的检测主要使用染色体分析法，而临床绝大部分遗传性疾病是基因病而不是染色体病，染色体发析法不能检出的。若使用PCR基因扩增法联合单链构型多态性分析（sscp）、限制性片段长度多态性分析（RFCP）等位基因特异性寡核某酸（Aso）点杂交或差异PCR可以很方便地检出单个基因的突变而且其准确性可达95%以上，因此使这一问题得到了较好的解决。常见的易致胎儿畸形的感染性疾病原体主要有单疱病毒（HSVⅡ）、风疹病毒（RV）、人巨细胞病毒（HCMV）、弓形体（TOX）及沙眼衣原体（CT）。以往这些病原体感染诊断比较困难，主要靠培养法进行确诊，而培养法费时，代价昂贵，而且受到采样、样本保存及用药等因素的影响，基本不能在临床中推广。PCR基因扩增法因其高敏感性、高特异性非常适合这些疾病诊断及疗效跟踪，是最值得推荐的检验方法。

       1、PCR基因扩增法在遗传性疾病产前诊断中的应用，遗传病是由于遗传物变化而引起的机体某一功能或缺陷或异常所致的疾病，其根本变化在于遗传物质。其类型包括单基因遗传病，染色体遗传病及多基因遗传病。遗传病诊断除询问病史，一般物理诊断，普通实验室检查及了解症状、体征外有特殊性。过去常应用系谱分析，染色体及性染色色质检验作为遗传病诊断的主要依据，再辅以相关的酶学分析从而作出诊断。随着分子生物不的迅速发展及其在遗传性病诊断中的广泛应用，基因诊断技术诞生，基因诊断技术为遗传病的临床诊断起了很大的促进作用。聚合酶链反应（PCR）技术是基因诊断主要技术之一。这种快速、灵敏的基因体外扩增技术与多种分子生物学手段相配合可以检出大部分已知的基因突变、基因缺失、染色体错位等，PCR技术日益成为遗传病诊断的最有效、最可靠的方法之一。以下举几个在国内有普遍意义的例子。

       （一）、PCR检测地中海贫血；地中海贫血（Thalassemia）是一种遗传性慢性溶血性贫血病，是世界上最常见且发病北最高的一种单基因遗传病。在两广、贵州、四川等地发病率较高，在广西等地高达15%。地中海贫血是由于基因突变造成珠蛋白的不平衡，使结构正常的肽链合成量减少甚至没有合成表现为溶血性贫血。接受累基因种类分为α、β、γ等，其中以 α、β地贫为最常见，危害了最大。珠蛋白基因簇位于人6号染色短臂上，有两个重复基因基因位于α1、α2、两个α基因及其旁侧序列有很大的同源性，易出现染色体不等交换，导致α基因缺失－α地贫。α地贫基因部分缺失有α1基因部分缺失、α2基因缺失、α1及α2基因同时缺失及非缺失型地贫。可以应用PCR技术扩增α1、α2基因从而检测这些基因是否缺失、突变等，从而对α型地中海贫血作出诊断。β地中海贫血基因缺陷主要表现为基因序列中单一核苷酸的突变，或少数碱基的缺失、插入，使正常β珠蛋白肽链合成减注或缺失。应用位点特异性寡核苷探针（Aso）进行PCR产物斑点杂交即可对其作出诊断。

       （二）、苯丙酮尿症，苯西酮尿证（PKU）是一种常染色体隐性遗传病，患者因苯丙酸羟化酶转化为酷氨酸，使苯氨酸及其代谢物在体内大量蓄积，出现脑组损伤及不可逆性智力发育障碍。PKU患者出生时正常，新生儿一经确诊为PKU停止母乳喂养采用低苯丙氨酸钦食疗法8—10年，可使患者智力水平发展维持正常。由于低苯丙氨酸钦食非常昂贵，一般家庭难以承受，因此，施行产前诊断，防止患儿出生是最好的选择。PAH只在肝细胞中表达，不能用血细胞，成纤维细胞、羊水、绒毛细胞进行酶活性分析，只能进行基因诊断。PKU的基因变化并非全部PAH基因的缺失，而是以点突变为主要表现形式，而且其突变位点很多。必须使用PCR扩增结合，ASO，SSCP或使用扩增片段长度多态性分析（AmpFLA）进行检测，这些技术都较复杂，检验人员须经专业培训。

       （三）、血友病，血友病是一组最为常见的遗传性凝血障碍，根据因子缺陷的不同分为甲、乙两型，（Ⅷ、Ⅸ因子缺陷），也有复合型血友病，但不常见。甲型血友病发病率为1/10000，Ⅷ因子基因位于G6PD基因附近，全长186Kb，大范围的基因重排（缺失、插入、重复）导致甲型血友病的病例很少，仅为Ⅷ因子缺陷的5%，大部分病人表现为单个或少数碱基的突变。由于Ⅷ因子基因长度为186Kb，突变位点多，而且新生突变频率高，从临床角度讲不能对每一个突变都检测，可对最为常见的几种突变类型进行检测，主要的检测手段是PCR结合RELP分析。乙型血友病发病率占血友病的20%，其基因变化及检测方法与甲型血友病类似。

       （四）、性别发育异常，区别雄性及雌性的物质基础是性染色体，哺乳动物胚胎发育中，雌性表型不需要任何调节，而雄性表型则由多因素决定，位于Y染色体上的指导雄性性别分ss化的基因命名为睾丸决定因子（TDF）。现代研究表明，SRY（Sex-determining region of Y chromosome）基因是TDF基因，位于Y染以体短臂末端。SRY区缺失易导致46XY核型个体发育成女性。进行基因检测可以检出SRY基因组的易位及缺失，从而诊断性别发育异常，这一探索性别异常的研究非常热门。另外还有一种46XY核型异常的病人即睾丸女性化，这是用于雄激素受体（androgen receptor,AR）基因缺欠，使雄激素的靶基因对雄激素不应答就答或不全而引起的，根据病情的不同有不同的表型，AR缺陷有很高的新生突变频率，表现为无家族史的散发病。AR基因长90Kb，位于X染色体上，AR基因异常大部分为个别基因碱基的突变，可以通过PCR结合ASO或SSCP检出。

       （五）、脆—X综合征，脆—X综合片（fragile-X Syndrome,Frax）是发病率最高的一种X-连锁的智力低下综合征（X-linked mental retardation XLMR）。因这种综合征与X染色体上的脆位点连锁而得名。大多数FRAX男性智商（IQ）低于50，并有随着年龄增长而下降的趋势。用人工酵母染色体（artificial yeast chromosome,YAC）克隆技术分离获得覆盖X-脆位点区域的YAC克隆，在这一克隆中获得一个能在人脑中表达的基因命名为FMR-1（fragile X mentai retardation-1）,FMR-1的5‘端有一个CGG（精）三核苷酸串（CGG）n,正常人群中（CGG）n中存在多态性，重复序列为6-46个，当重复超过52个时，此区域的分裂呈不稳定，导致重复序列大幅度增加，无临床表现的携带者插入片段长度小于500bg，有临床表现者，长度都大于600BP而且伴有甲基化。人们将500bp作为前突变与全突变的分界线。对Frax的诊断以前用细胞遗传学的方法检测脆位点，实验条件严格，成功率不高。现在采用分子遗传学方法即可诊出前突变及全突变。用PCR扩增CGG重复序列，检测扩增产物的长度。突变基因的扩增片段增大，体细胞异质性时出现多条长度不等的扩增带甚至拖尾成一片，或者因为扩充的全突变插入片段过长超出PCR扩增能力而结果无扩增现象。

       2、PCR基因扩增法在“Torsch”诊断中的应用，在妊娠早期（1-3个月），有些病原微生物的感染易导致胎儿畸形，这些病原体中最常见的有弓体（TOX）、风疹病毒（RV）、单纯疱疹病毒（HSV）、沙眼衣原体（CT）、及巨细胞（HCMV），对这几种病原体的检测根据其英文词首简称为Torsch试验。

       （一）、弓形体的PCR检测，弓形体有广泛的自然疫原性，人体多为隐性感染，抵抗力低时可以有临床表现。弓形体的诊断较困难，血清学方法敏感性较高但有交叉性出现假阳性而且无法确定近期感染、远期感染或一过性感染。确诊的方法是活组织检查或动物接各，这些方法阳性率太低不能推广。PCR检测可以检出样本中1-2个病原体而且准确性高，是目前对弓形体检测最优秀的方法。作为优生优育检查应于妊娠前或妊娠早期取全血样本，可以用EDTA或肝素抗凝，以EDTA抗凝效果最好，检测外周血白细胞中是否有TOX存在。对于不孕，多次自然流产或养小动物的产期妇女，作弓形虫检测有更重要的临床意义。

       （二）、风疹病毒感染：风疹病毒（RV）是一种单股正极性RNA病毒，人是风诊病毒的唯一宿主。RV感染可以引起胎儿的畸形，影响胎儿免疫系统的发育，因此RV检测在优生优育工作中显得非常重要。RV检测可以用直接培养法及IgM抗体测试法。培养法费时很长而且常受到其它病毒的干扰，IgM测定法结果了不太准确，PCR法敏感性及特异性都很高而且简便快速，是RV感染最优秀的测试方法之一。风疹病毒侵入体内后在上呼吸道增殖而出现症状，面部出现丘疹，迅速遍及全身。样本采用妊娠母亲的咽部拭子、血清、产妇的绒毛或妊娠如羊水等。RV病毒是RNA病毒，PCR扩增较复杂，应注意样本的采集时机，操作的准确性。

       （三）、单纯疱诊病毒，单纯疱疹病毒（herpes simplex virus,HSV）是一种DNA病毒，可引起多器官的炎症，可通过性接触传播。HSVⅡ感染复发率高，80%的感染者于12个月内复发。HSV感染后经机体免疫系统清除，少数病人终生携带，体弱时复发。PCR法检测HSV敏感性高而且可以直接对HSVⅠ/Ⅱ型进行分型鉴定。

       （四）、沙眼衣原体，沙眼衣原体（CT）不仅能引起沙眼而且能引起生死器感染，是一种性传播性疾病。与淋病（NG），梅毒等经典性传播性疾病不同，CT易经其它接触途径传播，少数地区对妊娠期妇女普查结果表明此人群中发病率高达20%-30%。在欧美等国家CT的感染已超过淋病而居性传播性疾病之首。衣原体感染常呈无症性或非特异性症状的隐性感染，不容易诊断。以往用培养法进行确诊，费时且敏感性、准确性都不足。PCR用于CT检测时应注意不同检测目的的取材不同，对于性传播性疾病诊断应取生殖道分泌物（查脱落细胞），而对于早期妊娠病人应查其全血样本，在妊娠后期或临产时再查阴道分泌物以便指导生育时产道清理。

       （五）、人巨细胞（HCMV），HCMV感染十分普遍，除少数原发性感染发生原发性单核细胞增多症外，极大多数为隐性感染。HCMV可以长期潜伏在体内，当机体免疫功能低下时，病毒会激活而造成严重疾病在妊娠期如果孕妇感染HCMV可以引起早产、畸形、死胎及新生儿巨细胞包涵体病等。HCMV属疱疹病毒科，可以从唾液、尿、宫颈分泌物及乳汁排出。HCMV“金标准”的诊断试验是用单层成纤维细胞作病毒培养，其它的实验检查有血清学的检测及包涵体检测。PCR是HCMV检测的一种新方法，用于检测的样本有血，生殖道分泌物拭子等，用于优生优育检测时应取血样本。对于早期妊娠病人若有HCMV感染应再检测羊水，或其它妊娠物，对病人认真及进跟踪检查，综合判断并采取相应的医疗措施。

        PCR应用于优生优育有很大的优越性，使这一技术的推广应用刚刚起步，应注意操作的准确性，尽量避免误诊。对感染性疾病首先应取孕妇血样检测，有可疑时或血中检出病原体核酸时应尽早作羊水等妊娠物检查。不管是否怀疑胎儿有严重遗传病倾和中或有感染引起的畸形风险，对胎儿的去留应尊重胎儿父母亲的意见。

       5、实时荧光定量PCR技术在研究方面的部分应用

       一、 新药开发研究，人用药物及其他药物

        针对一些感染性疾病的药物，如各种病毒病、细菌病等，在新药的开发过程中，快速了解药物对疾病进程的影响可以为新药开发节约大量的人力、时间和资金，与以前所用的Elisa等方法相比，实时荧光定量PCR技术可以快速、准确、定量、灵敏地测定血液或组织中病原体的含量，因此有利用分析药物的作用效果，为比较不同的配方的疗效、用药量、用药时间等等提供快速、定量的评价。

        此方法除了用于人用药物以外，还可以用于畜用药物，甚至其他经济动物及植物的药物研究等，因此其在药物研究方面的应用范围是很广的。

       二、 超早期感染用药物及疗法的研究与开发

        实时荧光定量PCR方法测定是血液中病毒核酸的含量，因此不必等到病人体内产生抗体，同时，由于其灵敏度与Elisa相比不可同日而语，在病毒感染的早期，即血液中病毒含量很低时就可以测定。因此就出现了一个新的领域，即在病毒或细菌含量很低时如何用药，用什么药以及用药量等进行研究，为将疾病消灭在超早期作出贡献。

       三、 药物疗效研究，人用药物及其他药物

        对于一些已经上市的新药或是应用了很长时间的老药，其用药的效果以及用药量及用药时间都可以进行进一步的研究，为更加合理化的应用这些药物为人类造福进行进一步的研究。以前所用的方法由于不能准确定量，灵敏度也不够，因此有很多需要研究的内容没有完成。这一方面需要研究内容很多，意义也很大。

       四、 新的愈后指标的研究

        对于感染性疾病，在药物作用至一定程度后，就认为可以停药了，但是应该在什么停药，现在大都没有一个明确的指标，现在所用的指标由于受到检测方法的灵敏度及准确性限制，这一指标未必合理，因此有必要对治愈的指标以及指标与复发率以及疾病转化为其他疾病之间的关系等进行进一步的研究，从而为药物或疗法彻底治愈疾病打下坚实的理论基础。

       五、 新诊断及检验试剂的开发

        现有的很多诊断及检验方法都不能同时满足快速、灵敏、定量的要求如现有培养法、Elisa法等等，而荧光定量PCR方法以则可以做到这一点，从而可为临床疾病、商检、粮油检验、食品检验、血液检验等等开发新的试剂，从而提高检验的灵敏度、速度及准确性等；这类试剂的种类是非常多的，所开发的试剂的社会效益及经济效益都是很巨大的。

       六、 血液检验漏检率

        由于实时荧光定量PCR方法比Elisa灵敏很多，因此，血站或血液研究所一般用来研究Elisa方法的漏检率，即分析Elisa方法测定为阴性的血样，再用实时荧光定量PCR方法来复检。复检时，一般24个Elisa阴性的血样混合成一个样本进行检测。上海用此方法在用于血液制品的血液中发现一例HIV，后经测定供血者，证实病人的确是HIV阳性。北京市红十字血液中心正在测定北京血站中5万份Elisa阴性血样的漏检率。由于不同地区所用的Elisa试剂、方法、批号等都不相同，因此不同地区都有必要进行这一工作。

        由于荧光定量PCR方法的快速、灵敏、定量的特点，其在研究及开发方面的应用是不胜枚举的，如研究个人基因型与药物疗效之间的关系等；研究人员也可以根据自己研究项目开发其新的用途。

       二、TL988实时荧光定量PCR检测系统产品介绍

       1、如何选择一款适合自己的PCR仪

        回顾分子生物学的发展历程，PCR技术的发明和普及无疑是最重要的篇章之一。而PCR技术在近20年的不断发展创新中，最受瞩目当属荧光实时定量PCR技术(real-time quantitative PCR, or qPCR)。定量PCR技术真正实现了PCR从定性到定量的飞跃，通过对PCR过程的实时监控，专一、灵敏快速、可重复地精确定量起始模版浓度，已经在科研和临床诊断领域得到了越来越广泛的应用。我公司从荧光定量PCR的原理入手，详细介绍荧光定量PCR仪的类型和技术，为定量PCR仪的选择提供详细参考。

        定量PCR仪主要由两部分组成，一个是PCR系统，一个是荧光检测系统。从前面的原理介绍不难看出选择定量PCR仪的关键--由于定量PCR必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的，对于定量PCR系统来说，重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等，更重要的还在于样品孔之间的均一性，以避免微小的差别被指数级放大。至于荧光检测系统，多色多通道检测是当今的主流趋势--仪器的激发通道越多，仪器适用的荧光素种类越多，仪器适用范围就越宽；多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光，仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品，通道越多，仪器适用范围越宽、性能就更强大。荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源，前者可配多色滤光镜实现不同激发波长，而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长，不过因为是单色，需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。监测系统有超低温CCD成像系统和PMT光电倍增管，前者可以一次对多点成像，后者灵敏度高但一次只能扫描一个样品，需要通过逐个扫描实现多样品检测，对于大量样品来说需要较长的时间。定量PCR仪需要考虑的另外一个因素是软件设计，这一点目前较新型号的仪器都有不错的配套软件可以满足常规使用。--随着定量PCR技术在临床诊断、疾病

       PCR实验室可分为样品制备、核酸扩散、产物分析3大区域，每个区域所用的设备不同，下面就给大家详细介绍一下PCR实验室每个区域都需要什么设备？

样品制备区：

       生物安全柜 ：防止有害悬浮微粒、气溶胶的扩散

       样本低温冰箱：零下20摄氏度，-80℃ 保存样本及DNA

       高速台式冷冻离心机：收集微生物菌体、细胞碎片以及其他沉淀物。 有些样品由于在常温下不太稳定，需要低温环境

       水浴锅或者金属浴：用于DNA杂交过程中水浴控温

       移液器：准确量取特定体积溶液

       紫外灯或者消毒车：空间环境消毒

       混匀仪：移取样本前需要混匀

       超净工作台：涉及对细菌的操作均需在超净工作台下完成

       低温摇床：用于大肠杆菌和酵母菌的振荡培养

       磁力搅拌器：加速溶解固体内容物

核酸扩散区：

       基因扩增仪：基因检测DNA/RNA扩增

       荧光定量PCR仪：核酸定量分析

       核酸提取仪：样品DNA/RNA提取

       移液器：准确量取特定体积溶液

       紫外灯或者消毒车：空间环境消毒

       超净工作台：涉及对细菌的操作均需在超净工作台下完成

       纯水装置：用于PCR,DNA测序需要超纯水

产物分析区：

       电泳仪：水平电泳用于核酸DNA/RNA检测，垂直电泳用于蛋白检测，转印电泳用于将蛋白转移到膜上做weatern检测

       凝胶成像系统/紫外检测仪：用于核酸琼脂电泳和蛋白聚丙酰胺的观察和拍照；紫外分析仪用于染色后核酸琼脂电泳胶观察，不能连接电脑

       电炉：电泳琼脂凝胶加热融化

       好了，今天关于“viia7荧光定量pcr仪”的话题就讲到这里了。希望大家能够通过我的讲解对“viia7荧光定量pcr仪”有更全面、深入的了解，并且能够在今后的学习中更好地运用所学知识。